Rémy è un topo piccolo con un grande desiderio: cucinare. Il protagonista vive poco lontano da Parigi, nella soffitta di una casa di campagna abitata da una anziana ma agguerrita signora. Il topino ha un padre di nome Django e un fratello, di nome Émile. Rémy, all’opposto dei suoi simili, possiede un olfatto ed un gusto molto raffinati, che lo portano a non voler mangiare spazzatura, come fanno i suoi simili, ma a voler sperimentare sempre nuovi sapori, e a camminare su due zampe, senza poggiare quelle anteriori perché le usa per mangiare.

A causa di questo, Rémy viene scelto come “esaminatore olfattivo” per la colonia: ogni volta che un membro della colonia porta qualcosa che intende mangiare, Rémy lo annusa e dice se il cibo sia commestibile. Tale compito gli viene assegnato dopo che ha salvato la vita al padre, che stava per mangiare un torsolo di mela infetto da veleno per topi. L’idolo di Rémy è il famoso cheffrancese Auguste Gusteau, la cui filosofia è Chiunque può cucinare, titolo del suo libro che ha ispirato Rémy. Dopo una recensione negativa da parte del severissimo critico gastronomico Anton Ego, però, il ristorante di Gusteau aveva perso una stella delle sue cinque, utilizzate per valutarne l’eccellenza. Poco tempo dopo Gusteau, caduto in depressione, era morto, e per questo motivo, secondo l’usanza, al ristorante era stata sottratta un’altra stella.

Un giorno, la colonia di cui Rémy fa parte viene scoperta dalla signora (Rémy ed Émile si erano intrufolati nella casa per cercare dello zafferano da mettere su un fungo trovato da Rémy e cucinato dai due con il fumo del camino): la proprietaria prende a fucilate i topi, costringendoli a fuggire su imbarcazioni di fortuna lungo un affluente artificiale della Senna. Nella confusione della fuga, Rémy rimane indietro per salvare il libro di Gusteau, si distacca dal gruppo e si perde nelle fogne di Parigi. Ritrovatosi bagnato, solo e affamato, risale le tubature finché non arriva in un appartamento dove si sta tenendo un rinfresco. Lì trova del pane e sta per mangiarlo quando gli appare il fantasma di Gusteau, che lo rimprovera dicendogli che lui il cibo non deve rubarlo ma cucinarlo, essendo un cuoco e non un ladro, e lo conduce sui tetti di Parigi fino al suo ristorante, governato da quello che era il suo vice, un odioso affarista di nome Nino Skinner.

Mentre Rémy osserva i cuochi al lavoro, arriva un giovane, Alfredo Linguini, figlio di una vecchia fidanzata di Gusteau, che cerca un posto di lavoro e viene assunto come sguattero. Linguini è maldestro e incapace perfino di pulire il pavimento, infatti, durante il suo lavoro, urta e fa cadere una pentola di zuppa che finisce sul pavimento. Per non farsi scoprire, riempie nuovamente d’acqua la pentola e versa all’interno spezie e verdure alla rinfusa, ottenendo un intruglio orribile. In quel momento Rémy cade dalla finestra sul tetto, finendo nella cucina; cercando di scappare di nascosto, passa davanti alla pentola della zuppa e non resiste alla tentazione di modificarla, inserendo gli ingredienti che ritiene opportuni per migliorare l’odore e il sapore.

Linguini scopre Rémy e lo imprigiona sotto un colapasta, ma viene a sua volta scoperto da Skinner con il mestolo in mano e sta per essere licenziato in tronco con l’accusa di aver cercato di cucinare, cosa inammissibile per uno sguattero: la zuppa nel frattempo è stata servita in sala a Solene Le Claire, una nota critica gastronomica, che rimane piacevolmente sorpresa (e il giorno dopo scriverà una recensione molto positiva sul locale). I cuochi credono che sia stato Linguini a cucinare la zuppa e per questo Skinner gli ordina di tornare il giorno dopo per prepararla di nuovo, sotto la sua supervisione. Rémy però viene infine scoperto e catturato; l’esecuzione è affidata a Linguini, che lo porta sulla Senna per annegarlo. Prima dell’esecuzione, Linguini si accorge che il ratto è in grado di capire le sue parole (annuisce e scuote la testa quando gli parla), e i due decidono di collaborare per ricreare il piatto. Inizialmente i due sono in difficoltà, poiché Rémy non riesce a trovare il modo di dare le indicazioni a Linguini senza essere visto, ma in seguito scoprono che il ragazzo muove gli arti in modo sincrono quando il topo gli tira certi ciuffi di capelli, come una marionetta. Il piatto viene preparato, risulta uguale all’originale e riscuote nuovamente un grande successo.

La delizia dei piatti preparati con l’abilità di Rémy e la prestanza del nuovo capo del ristorante fanno riacquistare una stella al locale, incuriosendo Anton Ego, che decide di testarlo. Con la sua fama e ricchezza, Linguini comincia però ad ignorare Rémy. Casualmente il topo ritrova suo fratello Émile e tutta la colonia, ed essi lo costringono a procurare loro cibo di qualità di nascosto prelevandolo dalla dispensa del ristorante. Una sera Linguini li scopre: lui e Rémy litigano e il ragazzo, adirato, caccia via il topo.

Il giorno dell’arrivo di Ego, Linguini non riesce a cucinare i piatti e, dopo la riconciliazione che ha con Rémy, ritornato nel frattempo, confessa a tutti che l’artefice di tutti quei piatti non era lui ma un topo: tutti i collaboratori se ne vanno inorriditi. Rémy però non si arrende e suddivide l’intera colonia di topi in gruppi: ognuno di questi dovrà lavarsi bene e successivamente occuparsi di una determinata attività di cucina. Alla fine Ego assapora una rielaborazione gourmet della ratatouille, piatto originariamente povero, che improvvisamente gli fa tornare in mente i ricordi della sua infanzia, quando gli accadde che, dopo essere caduto dalla bici, mangiò la ratatouille preparata dalla madre e riacquistò il buonumore.

La cucina di Rémy riesce a conquistare il critico, che desidera fortemente parlare con lo chef. A quel punto Linguini e Colette (tornata al ristorante nel frattempo) decidono di dirgli la verità, presentando il topo chef al critico gastronomico (dopo avergli fatto attendere che il locale si svuotasse); Ego il giorno dopo scrive una recensione lusinghiera sul locale che riconquista le cinque stelle.

Skinner però, per vendicarsi, denuncia all’autorità sanitaria la presenza di topi in cucina, quindi il locale viene chiuso e così facendo egli stesso diviene definitivamente disoccupato. Ego viene screditato come critico e decide di dimettersi. Invece Linguini, Colette e Rémy non si perdono d’animo, così aprono il Ratatouille, piccolo ma molto frequentato bistrot, dove la gente mangia in sala mentre la colonia di topi riposa in soffitta e mangia in un piccolo ristorante realizzato apposta per loro. Quanto all’ex-critico Ego, decide di investire assieme a Linguini e Rémy su diverse gamme di prodotti culinari e diventa un assiduo frequentatore del ristorante, dove ormai il topino Rémy può realizzare il proprio sogno di essere uno chef.